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作者的工作建立了一种创新方法来探索NgAgo 活性（以及其他pAgos 的活性），并确定了将导致其发展为下一代生物工具的关键蛋白质特征。基于上述原理，可以在病毒载体中构建DIO和反向基因。感染Cre阳性细胞后，可以让Cre阳性细胞表达基因，称为DIO（Cre-on）结构；如果预先包装的基因是正向的，则Cre阳性细胞不表达基因，而其余细胞则表达基因，称为DO（Cre-off）结构。
为了确认NgAgo不仅作用于质粒上的靶位点，作者还对基因组位点arpB进行了靶向敲除。为了确定NgAgo 切割DNA 的关键区域，作者构建并表达了NgAgo 的repA 结构域、不含repA 结构域的截短NgAgo (N-del) 以及带有D663A/D738A 点突变的全长蛋白（图1）。 2D）。
LoxP（基因座
文章利用AAV血清型和特异性启动子结合Cre-Loxp系统，实现了目的基因在Cre小鼠特定组织中的表达；例如：AAV5-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry通过大脑立体定位Cre小鼠大脑DRN区域注射到Vglut3-，结合化学遗传学实现DRN区域神经元细胞的激活。
NgAgo 在含有两种质粒的细胞中表达，并用针对不同mNeonGreen 链的磷酸化单链gDNA (P-ssDNA) 转化到细胞中（图4B）。由于NgAgo蛋白表达量极低，且容易形成包涵体，作者采用MjAgo（最相似的古菌pAgo）作为模板，构建了NgAgo的蛋白结构。 NgAgo 具有典型的N 端、PIWI、MID 和PAZ 结构域，以及推定的单链DNA 结合(repA) 结构域。
作者从可溶性和不溶性组分中纯化了野生型NgAgo，以测试5P-ssDNA 向导依赖性DNA 切割，并使用既定方法在纯化过程中重新折叠不溶性NgAgo。 NgAgo 使用PIWI 中保守的催化四分体和新型未表征的repA 结构域来切割DNA。实验结果表明，靶向arpB确实降低了存活率（图4C），表明NgAgo也可以切割基因组DNA，这与作者靶向切割质粒的结果一致。
FRT是Flp的识别位点，全长48 bp，包括三个13 bp重组酶结合区和一个含有Xba I位点的8 bp不对称间隔区。因此，本实验表明NgAgo确实能够在gDNA的指导下特异性切割目标DNA。